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亲和层析法纯化抗体常见问题
如何对血清、腹水、培养物上清液等来源的抗体样品进行预处理?
最常用的预处理方法是沉淀法。对于腹水中的脂蛋白,常用硫酸右旋葡糖酐沉淀,或是在pH=7时,采用PVP沉淀b-脂蛋白和球蛋白。上样时若腹水样品太粘稠可以使用上样缓冲液稀释样品。对于白蛋白等杂蛋白,可以使用分级沉淀法去除,如硫酸铵沉淀、羊脂酸沉淀等。利用脱盐柱或透析可以除去盐离子并更换缓冲液。
纯化不与Protein A或G结合的IgM、IgY该怎么选择填料?
(1)通常采用沉淀法结合凝胶过滤法纯化IgM,但对于大量纯化抗体,这种方案繁琐且产量低。
(2)采用Protein L亲和填料,特异性的结合κ轻链,对纯化抗体片段及完整地抗体IgG、IgM和IgA很有用。
(3)嗜硫填料是根据其配基与抗体间的二硫键产生特异性相互作用,中性条件下吸附、洗脱,纯化后蛋白活性高,是一种通用型抗体纯化手段。
怎么纯化抗体Fab 片段?
(1)Protein L可以特异性的结合抗体的κ轻链,因此,只要Fab 片段中含有κ轻链,就可以选择Protein L填料进行纯化。
(2)Protein G 除了可以特异性结合IgG 的Fc 片段,还可以特异性低亲和的与某些抗体Fab片段结合。
(3)Protein A只结合IgG的Fc片段。采用流穿模式,将纯的IgG酶解后过Protein A填料,Fab在流穿峰,Fc片段结合在填料上。
如何提高抗体回收率?
(1)更换亲和力更高的填料。
(2)对于Protein A填料,结合pH可以升至8-9。
(3)填料多次使用后残留物增多,载量降低,建议用6M盐酸胍或70%乙醇清洗填料。对于耐碱填料可以使用0.1-0.5M NaOH清洗。
为什么洗脱液中没有正确条带?
(1)首先看样品是否结合,抗体种属亚型与亲和填料是否有亲和力,结合缓冲液pH是否中性,流穿中抗体是否有减少,可将原始样品和流穿同时跑SDS-PAGE电泳进行分析。
(2)再看样品是否与填料结合太牢固,没有洗脱下来,建议用pH更低的缓冲液洗脱。
(3)洗脱后酸性条件下抗体是否水解,可在收集管中预先加入中和液或精氨酸等保护剂,或者选择能在近中性条件下洗脱的填料。
洗脱后抗体纯度不高怎么办?
(1)洗杂是否完全?可取最后洗杂液跑SDS-PAGE电泳进行分析。
(2)适当提高结合时盐离子浓度,或在洗杂液中加入低浓度的非离子型去垢剂,降低非特异性吸附。
(3)上样前样品预处理,除去部分杂质。
(4)采用两步纯化,先亲和层析纯化,后经离子交换层析,除去HCP 、脱落的 Protein A以及部分聚体等等,得到纯度更高的抗体。
体外培养表达IgG,如何避免培养基中如小牛血清IgG干扰?
(1)血清可先用Protein G预处理,在培养前除去IgG。或选用IgG含量较低的血清。
(2)样品先用Protein A或G纯化,得到的抗体再经过疏水层析除去牛IgG。
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